Altri studi su proteine nel nostro laboratorio

I recettori orfani tirosin-chinasici (ROR) sono recettori tirosin-chinasici ancora poco caratterizzati, coinvolti nello sviluppo embrionale e nella differenziazione muscolare. La loro rilevanza è evidenziata dalla sovraespressione dei geni ROR durante la progressione tumorale, in particolare nelle neoplasie solide ed ematologiche. Poiché l’espressione di ROR1 è fortemente limitata nelle cellule tumorali e rimane bassa nei tessuti adulti sani, questo recettore rappresenta un interessante marcatore per terapie mirate. Parallelamente allo sviluppo di piccole molecole dirette contro i domini chinasici intracellulari, anticorpi specifici per i domini Kringle di ROR1 e ROR2 umani hanno mostrato attività antitumorale selettiva. Per chiarire l’architettura extracellulare di questi recettori, abbiamo prodotto, cristallizzato e determinato ad alta risoluzione la struttura del dominio Kringle isolato di ROR1 umano (hROR1-KRD).

Rappresentazione schematica di hROR1-KRD. La catena polipeptidica è colorata dall’estremità N-terminale (blu) a quella C-terminale (rossa). I legami disolfuro sono rappresentati come sfere e bastoncini, mentre sono indicati i residui che delimitano gli elementi di struttura secondaria.

Grazie alla collaborazione con la Dott.ssa Alessandra Villa (Philochem AG) e il Prof. Dario Neri (ETH Zurigo), abbiamo contribuito alla caratterizzazione strutturale di immunocitochine di grado clinico. Abbiamo determinato la struttura tridimensionale del frammento diabody L19 e utilizzato SEC-SAXS e microscopia elettronica a colorazione negativa per caratterizzare tre immunocitochine flessibili a lunghezza intera. I risultati mostrano che la caratterizzazione strutturale a bassa risoluzione fornisce informazioni complementari utili per il controllo di qualità delle immunocitochine e può guidare la progettazione e l’ottimizzazione di questi reagenti proteici chimerici per lo sviluppo clinico.

Rappresentazione schematica dei modelli molecolari delle immunocitochine L19-IL2, L19L19-IL2 e IL12-L19L19 ottenuti da dati SEC-SAXS.

Grazie alla collaborazione con il Prof. Ivo Frébort e il Prof. Petr Galuszka (Università Palacký di Olomouc, Repubblica Ceca), abbiamo contribuito alla caratterizzazione strutturale di una classe di proteine scoperta di recente e denominata “Lonely Guy” (LOG). Questi enzimi sono centrali nella biosintesi delle citochinine, poiché convertono nucleotidi citochininici inattivi in basi libere biologicamente attive. Abbiamo determinato la struttura tridimensionale di una proteina LOG fungina di Claviceps purpurea, sia in assenza sia in presenza di ligando. Le nostre analisi strutturali e biochimiche hanno chiarito il riconoscimento del substrato e identificato una firma di sequenza accurata per distinguere gli enzimi LOG-simili con ripiegamento di Rossmann, coinvolti nel metabolismo dei fosforibonucleotidi, dalle lisina decarbossilasi annotate erroneamente.

Panoramica della struttura tridimensionale di cpLOG, rappresentata come cartoon. Il prodotto di reazione fosforibosio, identificato nella tasca catalitica, è mostrato come sfere.

Burkholderia cenocepacia è un raro patogeno opportunista e rappresenta un’importante minaccia tra le infezioni respiratorie nelle persone affette da fibrosi cistica. È particolarmente difficile da trattare a causa dell’elevata resistenza agli antimicrobici di rilevanza clinica. Il suo sistema di comunicazione cellulare basato sul quorum sensing controlla diversi processi essenziali per la virulenza batterica, tra cui la formazione del biofilm e la produzione di proteasi e siderofori. Colpire gli enzimi coinvolti in questa via rappresenta quindi una promettente strategia terapeutica. Questa ricerca è stata svolta in collaborazione con il gruppo di Microbiologia Molecolare del nostro Dipartimento, diretto dalla Prof.ssa Giovanna Riccardi.

DfsA. La crotonasi bifunzionale DfsA è un componente chiave della via di quorum sensing di B. cenocepacia. Abbiamo determinato la struttura tridimensionale dell’enzima in complesso con il prodotto di reazione non fisiologico acido laurico. La caratterizzazione biochimica ha mostrato che, a differenza del prodotto fisiologico BDSF (Burkholderia diffusible signaling factor, acido cis-2-dodecenoico), l’acido laurico viene rilasciato lentamente e si comporta come un prodotto finale inibitorio. La struttura spiega come DfsA possa accogliere lunghe catene alifatiche senza richiedere i cambiamenti conformazionali proposti in precedenza e fornisce un modello per lo sviluppo strutturale di composti antivirulenza.

Rappresentazione schematica della struttura di DfsA, colorata dall’estremità N-terminale (blu) a quella C-terminale (rossa). La profonda cavità idrofobica è mostrata come una griglia grigia, mentre il prodotto di reazione non fisiologico acido laurico è rappresentato come sfere vicino alla tasca catalitica.

CepI. I nostri collaboratori hanno identificato efficaci inibitori non competitivi della sintasi delle acil-omoserina lattoni CepI di B. cenocepacia. Poiché CepI non ha cristallizzato né in assenza né in presenza di questi inibitori, abbiamo combinato modellistica per omologia e docking in silico. La mutagenesi sito-diretta e i saggi biochimici hanno quindi validato i siti di legame previsti e chiarito il meccanismo d’azione di questi potenziali farmaci.

Rappresentazione schematica del modello per omologia di CepI, colorata dall’estremità N-terminale (blu) a quella C-terminale (rossa). I siti noti di legame del substrato sono indicati con asterischi, mentre i siti ottimizzati di legame degli inibitori identificati mediante docking molecolare sono mostrati come punti colorati.