Caratterizzazione degli eventi di riconoscimento molecolare e regolazione nelle giunzioni neuromuscolari

La segnalazione tra nervi e cellule muscolari richiede la presenza di sinapsi stabili, chiamate giunzioni neuromuscolari (NMJ). Durante lo sviluppo delle NMJ, l’aggregazione dei recettori dell’acetilcolina (AChR) sulla membrana delle cellule muscolari è cruciale per la formazione delle connessioni sinaptiche. Nonostante il gran numero di studi, si sa ancora molto poco sui vari passaggi necessari per formare una sinapsi neuromuscolare funzionale e su come questo processo porti al trasferimento dei messaggi dai neuroni ai muscoli. Un processo chiave nell’aggregazione degli AChR è l’interazione tra il grande proteoglicano Agrina e il suo recettore, un complesso macromolecolare situato sulla membrana delle cellule muscolari, costituito dal co-recettore proteina 4 correlata al recettore delle lipoproteine ​​a bassa densità (LRP4) e dal recettore tirosin-chinasi muscolo-specifico (MuSK). Il legame diretto dell’Agrina a LRP4 provoca cambiamenti conformazionali nel co-recettore, con conseguente autoattivazione di MuSK e cascate di segnalazione a valle. In definitiva, l’attivazione del recettore mediata dall’agrina innesca l’aggregazione dei recettori dell’acetilcolina (AChR) sulla superficie della cellula muscolare, mediata dalla sinapsina (RapSyn). Questo processo è regolato dalla scissione proteolitica dell’agrina da parte di una proteasi specifica della sinapsi chiamata neurotripsina. Insieme, queste proteine ​​hanno un forte impatto sulle malattie neuromuscolari congenite e autoimmuni, tra cui la miastenia grave, una patologia altamente invalidante (che ad oggi colpisce 15-20 persone ogni 100.000 abitanti). Utilizziamo diverse tecniche sperimentali per studiare le strutture molecolari e le funzioni dei ligandi e dei recettori sinaptici, al fine di chiarirne il ruolo nei processi che portano alla formazione e alla stabilizzazione delle giunzioni neuromuscolari. Integriamo la conoscenza delle funzioni di queste proteine ​​con approfondite caratterizzazioni biochimiche e biofisiche delle loro interazioni reciproche.

La figura mostra una panoramica della complessità alla base della formazione della giunzione neuromuscolare e dei suoi organizzatori extracellulari: il recettore dell’agrina, composto da LRP4:MuSK e dai suoi effettori associati.

L’obiettivo finale a lungo termine della nostra ricerca è quello di fornire un’accurata “mappa molecolare” dell’ambiente sinaptico e di trasporre le osservazioni a livello cellulare. Acquisire conoscenze sui meccanismi di omeostasi delle giunzioni neuromuscolari contribuirà in modo significativo alla futura progettazione di composti potenzialmente in grado di contrastare gli effetti di importanti disfunzioni neuromuscolari (tra cui la miastenia grave), con importanti conseguenze sulla qualità della vita dei pazienti affetti da malattie neuromuscolari.

MuSK– La chinasi muscolo-specifica (MuSK) è un recettore transmembrana monotopico responsabile di eventi di segnalazione chiave durante lo sviluppo e il mantenimento delle giunzioni neuromuscolari. La porzione extracellulare N-terminale di MuSK è caratterizzata da molteplici domini, ampiamente coinvolti nelle interazioni molecolari con il co-recettore LRP4 durante l’attivazione di MuSK. I meccanismi molecolari alla base dell’attivazione di MuSK attraverso interazioni molecolari self e non-self sono ancora poco compresi. Abbiamo prodotto e caratterizzato mediante tecniche di ricombinazione il terzo dominio Ig di MuSK umano (hMuSK-Ig3) utilizzando la cristallografia a raggi X. La determinazione di fase sperimentale a lunga lunghezza d’onda ha rivelato casualmente diversi ioni potassio legati alle dieci copie di hMuSK-Ig3 presenti nell’unità asimmetrica cristallografica, disposte in modo super-elicoidale con contatti molecolari interdominio antiparalleli appaiati che coinvolgono foglietti β di due molecole vicine. Nel complesso, i nostri dati evidenziano caratteristiche strutturali uniche di questo dominio, tra cui il legame con ioni metallici e punti caldi di contatto superficiale, che potrebbero suggerire siti di contatto rilevanti per le interazioni con il co-recettore LRP4 e/o altri partner molecolari coinvolti nella segnalazione di MuSK.

La figura mostra una sintesi visiva della caratterizzazione della struttura cristallina di hMuSK-Ig3.

Neurotripsina – La neurotripsina (NT) è una serina proteasi multidominio del sistema nervoso con un solo substrato noto: il grande proteoglicano agrina. È stato osservato che la NT è coinvolta nel mantenimento/ricambio delle giunzioni neuromuscolari e nei processi di plasticità sinaptica nel sistema nervoso centrale. Ruoli che sono stati legati alla sua attività enzimatica, localizzata nel dominio serina-proteasi (SP) C-terminale. Tuttavia, lo scopo dei restanti 3-4 domini ricchi di cisteina del recettore scavenger (SRCR) della NT non è ancora chiaro. Abbiamo determinato la struttura cristallina del terzo dominio SRCR del NT murino (mmNT-SRCR3), immediatamente precedente al dominio SP, e abbiamo eseguito un’analisi strutturale comparativa utilizzando strutture SRCR omologhe. I nostri dati e l’elevato grado di conservazione strutturale con domini omologhi evidenziano possibili ruoli funzionali per gli SRCR del NT. Analisi computazionali e sperimentali suggeriscono l’identificazione diuna potenziale regione di legame per gli ioni Ca²⁺, noti per regolare l’attività enzimatica della NT. Inoltre, i confronti di sequenza e struttura consentono di individuare regioni di interesse che, in studi futuri, potrebbero risultare coinvolte nel riconoscimento o nel legame dell’Agrina, oppure nelle interazioni con partner della NT non ancora identificati.

La figura mostra una rappresentazione schematica della struttura tridimensionale del terzo dominio ricco di cisteina del recettore scavenger della neurotripsina murina (NT-CRD3).